diplomová práce

Průtokové komůrky pro mikroskopii živých buněk

Text práce 2.63 MB

Autor práce: Ing. Jana Čolláková

Ak. rok: 2010/2011

Vedoucí: Ing. Martin Antoš, Ph.D.

Oponent: Ing. Jan Ježek, Ph.D.

Abstrakt:

Byla navržena a zkonstruována průtoková komůrka pro dlouhodobé pozorování živých buněk v transmisním, koherencí řízeném holografickém mikroskopu (CCHM), který byl vyvinut v Laboratoři experimentální biofotoniky na Ústavu fyzikálního inženýrství VUT v Brně.
CCHM umožňuje vyhodnocovat dynamické změny uvnitř živé buňky díky kvantitativní informaci o fázovém posuvu pro každý obrazový bod. Aby se experimentálně prokázaly  výhody CCHM, je důležité dlouhodobě udržovat optimální kultivační podmínky přidáváním čerstvého kultivačního média pro pozorované buňky přímo v mikroskopu. Průtoková komůrka umožňuje jak výměnu kultivačního média, tak aplikaci biologických činidel bez nutnosti vyjmutí komůrky z mikroskopu, jak je tomu u stacionárních komůrek. Můžeme tak sledovat životní projevy před aplikací činidel a reakci buněk po aplikaci.
Na základě publikací s řešenými návrhy průtokových komůrek, uvedených v předložené diplomové práci, byl realizován originální průtokový systém s příslušenstvím, vyhovující konstrukčnímu řešení CCHM. Byly rovněž diskutovány vlastnosti proudění a proces výměny kapalin v průtokové komůrce a na základě provedených simulací byl modifikován tvar vnitřního prostoru komůrky. Funkčnost a použitelnost průtokové komůrky byla experimentálně prokázána v CCHM i v jiných mikroskopech. V navržených průtokových komůrkách byly úspěšně pozorovány reakce nádorových a epiteliálních buněk na změnu prostředí z kultivačního média na fyziologický roztok.

Klíčová slova:

Koherencí řízený holografický mikroskop, zobrazování živých buněk, průtoková komůrka.

Termín obhajoby

20.6.2011

Výsledek obhajoby

obhájeno (práce byla úspěšně obhájena)

znakmkaAznamka

Klasifikace

A

Jazyk práce

čeština

Fakulta

Ústav

Studijní program

Aplikované vědy v inženýrství (M2A-P)

Studijní obor

Přesná mechanika a optika (M-PMO)

Složení komise

prof. RNDr. Tomáš Šikola, CSc. (předseda)
prof. RNDr. Miroslav Liška, DrSc. (místopředseda)
prof. RNDr. Bohumila Lencová, CSc. (člen)
doc. RNDr. Josef Kuběna, CSc. (člen)
prof. RNDr. Jiří Komrska, CSc. (člen)
prof. RNDr. Pavel Zemánek, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Petr Dub, CSc. (člen)
prof. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Ivan Křupka, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Jiří Spousta, Ph.D. (člen)
RNDr. Antonín Fejfar, CSc. (člen)

Posudek vedoucího
Ing. Martin Antoš, Ph.D.

Předložená práce má 49 stran, obsahuje 1 tabulku a 31 obrázků, z nichž 7 obrázků je převzato.
Cílem bylo navrhnout, vyrobit a ověřit funkčnost průtokových komůrek k pozorování živých buněk s ohledem na parametry digitálního holografického mikroskopu. V úvodních částech práce diplomantka zpracovala podrobný přehled historie vývoje konstrukce průtokových komůrek a zformulovala požadavky ke stavbě vlastní komůrky. Následně provedla simulace proudění kapaliny v programu Ansys Fluent pro navržené tvary vnitřního prostoru komůrky. Skutečná výměna kapalin při gravitačním zaplavování vnitřního prostoru komůrky byla v souladu s provedenými teoretickými simulacemi. Bylo prokázáno, že vyrobené průtokové komůrky umožňují bezproblémovou dlouhodobou kultivaci živých buněk a nepřetržité sledování jejich reakcí před a po výměně média.

Jana Čolláková absolvovala týdenní odborný kurz ve Fakultní nemocnici Královské Vinohrady v Praze, kde si v Laboratoři buněčné biologie a kultivací osvojila základní postupy buněčné kultivace. Při ověřování funkčnosti průtokového systému v transmisním koherencí řízeném holografickém mikroskopu postupovala diplomantka promyšleně a systematicky. K řešení diplomové práce přistupovala zodpovědně a všechny její cíle úspěšně splnila.

Práci doporučuji k obhajobě a hodnotím ji známkou velmi dobře/B.
Kritérium hodnocení Známka
Splnění požadavků a cílů zadání A
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod B
Vlastní přínos a originalita B
Schopnost interpretovat dosažené vysledky a vyvozovat z nich závěry B
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii A
Logické uspořádání práce a formální náležitosti B
Grafická, stylistická úprava a pravopis B
Práce s literaturou včetně citací A
Samostatnost studenta při zpracování tématu A

Známka navržená vedoucím: B

Posudek oponenta
Ing. Jan Ježek, Ph.D.

Předložená práce je formálně rozdělena do pěti kapitol. První kapitola uvádí důvody vzniku pozorovacích komůrek a jejich historický přehled. Dále nastiňuje předpoklady ze kterých se vycházelo při samotném návrhu komůrky popsaném ve druhé kapitole. Ve druhé kapitole je popsán konstrukční návrh komůrky včetně jejího uchycení na stolek mikroskopu. Následující kapitola se zabývá prouděním tekutiny komůrkou a to jak teoretickým rozborem v programu Fluent, tak i reálným měřením. Ve čtvrté kapitole jsou ukázány experimentální výsledky použití navržené komůrky v práci s živými buňkami. V závěru jsou shrnuty dosažené výsledky.
Členění diplomové práce a sled jednotlivých kapitole je logické, práce je vhodně a přehledně zpracována. Po gramatické stránce hodnotím práci jako dobrou. Občas se v delším souvětí ztratí shoda podmětu s přísudkem, např. v první větě kapitoly 1.5.4. Co se týká stylistické stránky práce chtěl bych vytknout vzhled obrázku číslo 14, bylo by přehlednější a vhodnější aby obě části obrázku byly na jedné stránce. Na to jak je jednoduchý je zbytečně velký. V grafu na obrázku číslo 15 je chyba v popisu dat a mělo by zde být uvedeno, že černá čára značí lineární aproximaci. V experimentech s měřením průtoků by bylo vhodné uvést zda změnu průtoku zaškrcováním hadičky lze kalibrovat bez nutnosti jeho měření při každém nastavení. Na základě teoretického popisu je uvedeno, že pro experimenty bude využito převážně jádro 3. Chybí mi experimentální porovnání s jádrem 1, tj. sada obrázků stejná jako obrázek 18, ale s jádrem 3. V kapitole 4.6 je popsán rozdíl v přežívání buněk v komůrce bez promývání roztokem a v komůrce se stálým průtokem. Rychlost průtoku 1 ml.min-1 je při objemu komůrky 0,8 ml pro tyto experimenty příliš vysoká. Buňky mohou být strhávány tokem kapaliny. Bylo by lepší zvolit rychlost výrazně nižší, aby k výměně média nepřispíval pouze tok kapaliny, ale i difúze.
Předloženou práci hodnotím jako zdařilou a vyváženou a doporučuji ji k obhajobě.
Kritérium hodnocení Známka
Splnění požadavků a cílů zadání A
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod B
Vlastní přínos a originalita B
Schopnost interpretovat dosaž. vysledky a vyvozovat z nich závěry B
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii A
Logické uspořádání práce a formální náležitosti A
Grafická, stylistická úprava a pravopis B
Práce s literaturou včetně citací A

Známka navržená oponentem: B