dizertační práce

Staphylococcus aureus v potravinách: Identifikace a produkce enterotoxinu v mléce a sýrech

Text práce 1.86 MB Teze 652.97 kB

Autor práce: Ing. Vendula Hrušková, Ph.D.

Ak. rok: 2011/2012

Vedoucí: Ing. Eva Kaclíková, CSc.

Oponenti: doc. RNDr. Alena Španová, CSc.,

Abstrakt:

Onemocnění z potravin (alimentární onemocnění) vyvolaná bakteriemi jsou stále aktuálním tématem v celosvětovém měřítku. Abychom zajistili výrobu zdravotně nezávadných potravin, je potřeba  nových poznatků o virulenci patogenů, které by doplnily již známé skutečnosti o jejich růstu a přeživání  v potravinách. Také potřebujeme vyvíjet rychlé a citlivé metody na detekci těchto patogenů.
Dizertační práce popisuje metodu na detekci S. aureus v potravinách, která je založená na PCR v reálném čase ve spojení s namnožením v selektivním médium. Dále pojednává o vlivu environmentálních faktorů na růst S. aureus a tvorbu enterotoxinů v mléce a sýrech.
Vyvinuli jsme rychlou a citlivou metodu na detekci S. aureus v potravinách s použitím selektivního namnožení a PCR v reálném čase. Nově vyvinutá metoda umožnila detekci S. aureus na druhý den od přijetí vzorku. Tato metoda může být použita jako rychlejší, citlivějsí a vysoce specifická alternativní metoda ke konvenční mikrobiologické metodě.
Zkoumali jsme vliv tří různých teplot, 8°C, 12°C a 20°C na růst S. aureus a tvorbu enterotoxinu D v pasterizovaném mléce a na růst, expresi genu sed a tvorbu enterotoxinu D v tekutém médiu s extraktem z mozku a srdce (BHI). Experimenty byly prováděny v malých skleněných fermentorech po 6 dní. Genová exprese byla sledována pomocí qRT-PCR a tvorba enterotoxinu D byla měřena pomocí imunologické metody ELISA. Růstová křivka v BHI měla stejný průběh při 20°C a 12°C, ale v při 12°C začal růst se spožděním. Při 8°C nebyl pozorován žádný růst. Růst S. aureus v mléce byl ve srovnání s BHI menší. sed mRNA byla detekována při 20°C po 4 hodinách  a při 12°C po 7 hodinách a produkce enterotoxinu se objevila v exponenciální fázi růstu. V mléce se produkce SED při 20°C a při 12°C objevila dříve, ale  celkové množství vyprodukovaného SED bylo nižší než v BHI. Při 8°C nebyla pozorována žádná produkce SED stejně jako v BHI. Dále byl zkoumán společný vliv nízké teploty 12°C a přítomnosti kompetitivní doprovodné mikroflóry pocházející ze surového mléka na růst S. aureus a produkci enterotoxinu v pasterizovaném mléce. Byl pozorován inhibiční účinek na růst a produkci enterotoxinů a vliv kompetice byl výraznější než vliv nízké teploty. Produkce enterotoxinu byla nízká a odpovídala růstu. Snížením množství doprovodné mikroflóry a zvýšením inokula došlo pouze k nepatrnému zvýšení produkce enterotoxinu. V další fázi byly dva různé typy sýrů zaočkovány S. aureus za účelem simulace sekundární kontaminace při výrobě sýrů. Vzorky byly odebírány v průběhu 4 týdnů. Kritické faktory jako jsou kompetitivní mikrofóra nebo pH, které jsou zodpovědné za regulaci virulence S. aureus byly sledovány. Snažili jsem se rozlišit situace při kterých: (i) není pozorován růst, ale objevuje se produkce enterotoxinu a (ii) dochází k růstu ale bez produkce enterotoxinu.

Klíčová slova:

Staphylococcus aureus, PCR v reálném čase, produkce enterotoxinu, mléko, sýr

Termín obhajoby

11.6.2012

Výsledek obhajoby

obhájeno (práce byla úspěšně obhájena)

znakmkaPznamka

Průběh obhajoby

Předseda komise představil doktorandku a předal jí slovo. V powerpointovém prezentaci trvající cca 20 minut přednesla Ing. Hrušková nejvýznamnější výsledky své práce. Po prezentaci byly přečteny dotazy, na které doktorandka odpověděla. Zodpověděla rovněž dotazy, které vzešly z diskuze. Dotaz: jakou metodou jste sledovali produkci enterotoxinu D + kvantifikace? Jaký je LD 50 stafylokokových enterotoxinů?

Jazyk práce

angličtina

Fakulta

Ústav

Studijní obor

Potravinářská chemie (DKCO_CHTP)

Složení komise

prof. Ing. Peter Šimko, DrSc. (předseda)
doc. RNDr. Alena Španová, CSc., oponent (člen)
doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. (člen)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (člen)
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (člen)

Posudek vedoucího
Ing. Eva Kaclíková, CSc.

Vendula Hrušková začala pracovať na Oddelení mikrobiológie a molekulárnej biologie Výskumného ústavu potravinárského v Bratislave v poslednom ročníku vysokoškolského štúdia na témesvojejdiplomovej práce, v ktorej sa venovala aplikácii molekulárno-biologických metód v detekcii potravinových patogénov so zameraním na Staphylococcus aureus.
Po ukončení štúdiasa rozhodla pokračovať vo svojej vedecko-výskumnej činnosti formou doktorandského štúdia, s vykonávaním experimentálnej časti práce na našom pracovisku. Úspešne nadviazala na dobrý vedomostný základ a metódy a postupy použité v diplomovej práci a osvojila si celý rad ďalších mikrobiologických, biochemických a molekulárno-biologických metód, menovite metódu polymerázovej reťazovej reakcie v konvenčnom aj real-time simplex a duplex usporiadaní. Rozvinula svoje schopnosti kriticky analyzovať a vyhodnocovať svoje výsledky a cieľa vedome postupovať v riešení výskumných zámerov. Časť práce venovanú vývoju metódy na detekciuS. aureus v potravinách založenej na TaqManreal-time PCR a validácii s referenčnou mikrobiologickou metódouriešila na našom pracovisku (Trnčíková T, Hrušková, V., Oravcová, K.,Pangallo D.,Kaclíková E.: Rapid and Sensitive DetectionofStaphylococcus aureus in Food UsingSelectiveEnrichment and Real-Time PCR Targeting a New Gene Marker. Food AnalyticalMethods 2, 2009, s. 241-250).
V rámci študijného pobytu na Univerzite v Lunde nadviazala na problematiku S. aureus v potravinách výskumom zameraným na vplyv environmentálnych faktorov na rast S. aureus a tvorbu enterotoxínov v mlieku a syroch.
Výsledky riešeniaoboch uvedených zámerovsú nesporným príspevkom k rozšířenou poznatkov a k zdokonaleniu kontroly a mikrobiologickém bezpečnosti potravín. Předkládaná práca je spracovaná na dobrej úrovni, spĺňa všetky požiadavky na dizertačnú prácu a preto ju môžem doporučiť na obhajobu.
Doktoranská  disertační práce Ing. Venduly Hruškové je  zaměřena na detekci význačného patogena potravinového řetězce S. aureus a na studium vlivu environmentálních faktorů na růst S. aureus a tvorbu enterotoxinů v potravinách. Řešená problematika  je velmi aktuální v celosvětovém měřítku z důvodu zajištění výroby zdravotně nezávadných potravin.    
Doktorandská disertační práce je napsána v anglickém jazyce. Práce je napsána výstižně, srozumitelně a s logickou návazností, což se jí podařilo. Práce má 107 stran a je členěna do 12 kapitol. V kapitole Introduction (Úvod) (2 strany) je zdůvodněn význam řešené problematiky. V kapitole 2.Theoretical part (Teoretická část) (16 stran) je souhrnnou formou pojednáno o S. aureus a onemocnění, které vyvolává, včetně faktorů prostředí, které ovlivňují růst S. aureus a  potravin, ve kterých se vyskytuje. Další část této kapitoly je věnována mikrobiologickým a molekulárně-genetickým metodám detekce S. aureus a jeho enterotoxinům.  V kapitole The aims  (Cíle práce) (1 strana) jsou výstižně charakterizovány cíle práce, které jsou rozděleny do dvou částí: první část se zaměřuje na vývoj metody detekce  S. aureus v potravinách pomocí PCR v reálném čase, druhá část na studium vlivu environmentálních faktorů na růst S. aureus a tvorbu enterotoxinů v mléce a sýrech.  Kapitola Materiál a metody (13 stran) uvádí, vedle studovaných kmenů, postupy, používané pro analýzu mléka a sýrů, které byly prováděny v malých fermentorech. Vzhledem k tomu, že  byla sledována exprese enterotoxinu, jsou uvedeny metody isolace RNA, cDNA syntézy a RT-PCR a dále přehledná schémata průběhu experimentů. Postupy vypracované pro detekci S. aureus jsou uvedeny v Supplements  (Přílohy) v publikovaném článku. V Supplements jsou uvedeny nejcennější výsledky doktorandské práce – jedná se o nové metody PCR využitelné pro rychlou diagnostiku S.aureus a Y. enterocolitica v potravinách. Další výsledky jsou shrnuty v kapitole Results (Výsledky práce)  (26 stran, 12 obrázků). Práce  mj. přináší nové poznatky týkající se vlivu různých teplot na růst S. aureus, expresi genu sed a tvorbu enterotoxinu D v pasterizovaném mléce a v BHI médiu. Dále byl prokázán vliv doprovodné mikroflory surového mléka na produkci enterotoxinu. Poslední část je věnována růstu a produkci enterotoxinů S. aureus po sekundární kontaminaci sýrů. Šestou kapitolou je Discussion (Diskuse) (7 stran), ve které autorka přesvědčivým způsobem dikutuje získané výsledky. Sedmou kapitolou je Conclusions (Shrnutí) (2 strany), osmou kapitolou jsou Future perspectives (Budoucí perspektivy) (1 strana), devátou kapitolou Reference (Literatura) (6 stran), desátou kapitolou List of abbreviations (Seznam zkratek) (1 strana). Jedenáctou kapitolou je List of publications (Seznam publikací) (1 strana) a Supplements (Přílohy) (12 stran) s přiloženými kopiemi 2 publikací in extenso.  Součástí práce je rovněž Souhrn v českém jazyce (1 strana) a Abstract (1 strana) v anglickém jazyce.

Předložená doktorandská práce svědčí o pracovním úsilí a elánu, s kterým autorka přistupovala k řešení úkolů. Lze konstatovat, že  cíle práce byly splněny. Doktorandka práci vypracovávala na dvou pracovištích v zahraničí. Výsledky práce týkající se rychlé diagnostiky S. aureus a Y. enterocolitica byly vypracovány ve Výzkumném ústavě potravinářském ( Food Research Institute) v Bratislavě, Slovenská republika,  a publikovány v r.2008 a v r.2009 v impaktovaných časopisech (Ing.V.Hrušková je 2. spoluautorkou práce a 1. autorkou práce). Výsledky druhé části práce vypracované na Lund University ve Švédsku byly v r. 2009 a 2010 publikovány  na vědeckých konferencích formou abstraktů (Ing. Hrušková je 2. a 3. spoluautorkou).
Doktorandskou  disertační práci Ing. Venduly Hruškové „Foodborne Staphylococcus aureus: Identification and enterotoxin production in milk and cheese“  po zodpovězení  dotazu doporučuji k obhajobě.