dizertační práce

Příprava a charakterizace komplexních nanočástic s využitím zejména frakcionace v tokovém poli a pokročilých spektroskopických metod

Text práce 8.88 MB Teze 842.43 kB

Autor práce: Ing. Jan Kotouček

Ak. rok: 2020/2021

Vedoucí: doc. RNDr. Jaroslav Turánek, CSc., DSc.

Oponenti: prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc. , doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.

Abstrakt:

Liposomy představují univerzální biokompatibilní a biodegradabilní nosiče pro celou řadu medicínských aplikací. Jako jediné z nanočástic byly doposud schváleny pro farmaceutické použití a celá řada přípravků na bázi liposomů je v klinickém testování. Klasické metody přípravy liposomů představují potenciální omezení v převádění technologie z laboratorního do průmyslového měřítka. Nové, mikrofluidní techniky tyto omezení do jisté míry překonávají a nabízejí nové možnosti kontrolované, kontinuální přípravy liposomálních částic. Důležitým prvkem při vývoji nových, nanočásticových systémů je jejich komplexní charakterizace a purifikace. Kromě ustálených chromatografických technik se dostátá do popření technika Frakcionace v tokovém v poli, a to zejména Frakcionace tokem v asymetrickém tokovém poli (Asymmetrical flow Field-flow fractionation). Tato relativně nová technika ve spojení z online detektory MALS/DLS/DAD-UV/dRI umožnuje purifikaci a charakterizaci komplexních vzorků. Hlavní výhoda této techniky spočívá v možnosti separace za nativních podmínek, což hraje důležitou roli při separaci zejména biopolymerů. Separace v „prázdném“ kanále poté eliminuje degradaci vzorku v důsledku nechtěných interakcí na rozhraní stacionární fáze. Teoretická část teto práce popisuje jednak možnosti přípravy, modifikace zejména liposomálních nanočástic. Sumarizuje jejich možnosti využití a charakterizaci. K tomu účelu jsou zde popsány optické metody na bázi dynamického rozptylu světla, Multi-angle dynamic light scattering a Nanoparticle tracking analysis a také neoptická metoda využívající průchodu částic membránou tzv. „particle by particle” metoda Tunable resistive pulse sensing. Samostatnou kapitolou teoretické části je technika Frakcionace tokem v asymetrickém tokovém poli ve spojení z výše uvedenými detektory. Důležité výsledky spojené s touto prací jsou sumarizovány v přiložených vědeckých publikacích. V této práci jsou poté uvedeny krátké přehledy a autorovy přínosy k těmto přiloženým publikacím.

Klíčová slova:

Liposomy, mikrofluidní směšování, dynamický a statický rozptyl světla, asymetrická frakcionace v tokovém poli, rekombinantní proteiny.

Termín obhajoby

16.9.2020

Výsledek obhajoby

obhájeno (práce byla úspěšně obhájena)

znakmkaPznamka

Průběh obhajoby

Předseda komise představil doktoranda a předal mu slovo. Ing. Kotouček má řadu pracovních zkušeností již od roku 2013. Má také pedagogickou praxi, kterou vykonával v letech 2018-20 (např. vedení praktik z molekulární biotechnologie). Doktorand se zúčastnil několika konferencí v ČR i v zahraničí v letech 2017-2018.

Jazyk práce

čeština

Fakulta

Ústav

Studijní program

Fyzikální chemie (DPCP_FCH_4)

Studijní obor

Fyzikální chemie (DPCPO_FCH_4)

Složení komise

doc. Mgr. Martin Vala, Ph.D. (předseda)
prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc., oponent (člen)
doc. RNDr. Petr Skládal, CSc., oponent (člen)
prof. Ing. Michal Čeppan, CSc. (člen)
prof. Ing. Martina Klučáková, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D. (člen)

Posudek vedoucího
doc. RNDr. Jaroslav Turánek, CSc., DSc.

Ing. Jan Kotouček pracuje na oddělení Farmakologie a Toxikologie, Výzkumný ústav veterinárního lékařství v.v.i. Pod mým vedením vypracoval disertační práci s názvem „Příprava a charakterizace komplexních nanočástic s využitím zejména frakcionace v tokovém poli a pokročilých spektroskopických metod“. Ve své práci se věnoval zejména metodám přípravy liposomů a jejich charakterizaci pokročilými metodami, a to zejména metodou frakcionace v tokovém poli (Field Flow Fractionatinon - FFF). Tato metoda není příliš rozšířena v laboratořích a ing. Kotouček tuto novou metodu zvládl po teoretické a praktické stránce velmi rychle a významně se podílel na publikovaných studiích, ve kterých tato metoda byla klíčovou pro získání relevantních dat. Tyto práce byly publikovány v prestižních časopisech Q1. Další metodou, kterou ing. Kotouček úspěšně zvládl, je poměrně nová metoda MADLS (multiangle dynamic light scattering). Přístroj jsme získali v rámci projektu OPVVV CEREBIT v roce 2019 a ing. Kotouček se intenzivně věnoval zvládnutí této pokročilé metody pro charakterizaci nanočástic. Třetí metodou, kterou se ing. Kotouček zabýval, je moderní příprava nanočástic mikrofluidním mísením. Tato metoda byla využita pro přípravu liposomů a ing. Kotouček se věnoval studiu mechanismu tvorby nanoliposomů při mikrofluidním mísení vodné fáze a alkoholového roztoku s rozpuštěnými lipidy. Zároveň se také zabýval biokonjugační chemií pro modifikace nanoliposomů a chromatografickou purifikací a FFF analýzou rekombinantních antigenů pro konstrukci vakcín a cílených terapeutik.
V rámci oddělení se podílí na řešení dílčích úkolů v rámci OPVVV projektu FIT, které jsou zaměřeny na vývoj nanočásticových nosičů vakcín a protinádorových preparátů. Jeho přínosu k řešení projektu si velmi cením a v průběhu řešení své disertační práce se vypracoval na klíčového pracovníka oddělení, který je zapojen do většiny vědecko-výzkumných aktivit.
    Po odborné stránce je ing. Jan Kotouček pracovníkem, u kterého jsou v rovnováze teoretické znalosti a praktické dovednosti. Dokáže samostatně pracovat s literaturou, připravit, realizovat a vyhodnotit experimenty, a také připravit rukopis odborné publikace. Absolvoval zahraniční stáž na pracovišti firmy Wyatt v Německu, kde se intenzivně zabýval metodou FFF. Prokázal jazykové a odborné schopnosti pracovat v kvalitním zahraničním týmu.
Podílel se jako spoluautor na vzniku řady experimentálních prací publikovaných v impaktovaných časopisech.
    Předpokládám, že ve své další kariéře bude vědeckým pracovníkem, který může připravit a realizovat samostatné projekty a stát se vedoucím vědeckým pracovníkem. Pro tuto roli má dobré předpoklady, a to jak odborné, tak lidské. Je nekonfliktní a přátelský, má zájem o vědeckou práci a je schopen kolektivní práce. Po úspěšném obhájení disertační práce by se měl zaměřit na přípravu vlastního výzkumného projektu v rámci postdoktorandského grantu. Rád mu budu nápomocen se získáním stáže na zahraničním pracovišti zaměřeném na moderní analytické metody pro komplexní charakterizaci a purifikaci biopolymerů a nanočástic.
    Během studia splnil všechny formální požadavky a předepsané zkoušky, podílel se na několika publikacích v impaktovaných časopisech a předložil disertační práci. Proto doporučuji, aby ing. Jan Kotouček byl připuštěn k obhajobě disertační práce s názvem „Příprava a charakterizace komplexních nanočástic s využitím zejména frakcionace v tokovém poli a pokročilých spektroskopických metod“ a v případě úspěšné obhajoby mu byl udělen titul Ph.D.

Dne 25. 7. 2020
doc. RNDr. Jaroslav  Turánek, CSc., DSc.
Školitel

Posudek oponenta
prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc.

Příprava a charakterizace komplexních nanočástic s využitím zejména frakcionace v tokovém poli a pokročilých spektroskopických metod

Autor:
Ing. Jan Kotouček
Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická

    Téma disertační práce je mimořádně aktuální. Nanočástice a nanotechnologie velmi razantně vstupují prakticky do všech oborů lidské činnosti. Protože jsou svojí povahou zcela unikátní, vyžaduje jejich studium nové a inovativní přístupy. Takto byla zaměřena vědecká práce ing. Jana Kotoučka, jejímž výsledkem je hodnocená disertace. Byla zaměřena na studium liposomů a nanočástic na bázi uhlíku. 
    V zadání byly stanoveny přesné cíle výzkumu, které byly experimentální prací beze zbytku splněny. Jedná se zejména o zvládnutí mikrofluidní techniky, která nabízí nové možnosti kontrolované kontinuální přípravy liposomálních nanočástic. Nanočástice je nutné komplexně charakterizovat a purifikovat. V tomto směru řadu výhod vykazuje technika frakcionace v tokovém poli, kterou se autor detailně zabývá.
    Autor je součástí týmu vysoce kvalifikovaných odborníků z různých oborů, které spojuje problematika nanočástic, nanotechnologií a jejich perspektivní využití především v biomedicíně. To zaručilo odborný růst ing. Jana Kotoučka, který doložil publikovanými výsledky své vědecké práce. V publikovaných pracích je popsán podíl ing. Kotoučka. Vždy se jedná o zásadní přínos.
    Ing. Jan Kotouček jednoznačně přispěl k rozvoji našich znalostí o nanočásticích a nanotechnologiích. V práci, kde je prvním autorem, optimalizoval tvorbu liposomů s cílem jejich chemické a morfologické stability. Ta je nezbytná pro přípravu diagnostických a léčebných prostředků na bázi liposomů. Podobný cíl měla i práce, na které se spolupodílel, zaměřená na cílení modifikovaných liposomů na trombus. Je málo znalostí o osudu nanočástic v organismu. Jedná se především o nedostatek informací, jak nanočástice ovlivňují imunitní systém a zda jsou/nejsou potenciálně prozánětlivými podněty. Tuto otázku úspěšně řešil jako spoluautor výzkumného projektu zaměřeného na ovlivnění inflamasomu uhlíkovými nanočásticemi. Podobný cíl má také společná práce, která aktivaci inflamasomu studuje v kontextu působení nanodiamantů. Za velmi perspektivní považuji podíl ing. Kotoučka na aplikacích nanotechnologií v oblasti vakcinologie. Jedná se o konstrukci vakcíny proti prasečímu cirkoviru. Z mého pohledu, jako klinického imunologa, lze za průlomové považovat výsledky studia zaměřené na alergenově specifickou imunoterapii zprostředkovanou sublinguálně aplikovanými mukoadhezivními nanovláknovými filmy. Tento směr výzkumu má obrovský klinický potenciál a mohl by být komercionalizován.
    Disertace je napsána srozumitelnou angličtinou. To umožní její využití jako zdroj informace ve světovém kontextu. Obsahuje velmi málo formálních nedostatků.
Závěr
    Student doktorského studia fyzikální chemie na VUT Brno, Fakulta chemická, ing. Jan Kotouček, jednoznačně svými publikovanými výsledky nebo výsledky, které jsou připraveny k publikaci, prokázal tvůrčí schopnosti v oboru fyzikální chemie. Jednoznačně splňuje požadavky standardně kladené na disertační práce v tomto oboru.

V Hradci Králové dne 12.8.2020

                            Prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc.
                            Přednosta
                            Ústav klinické imunologie a alergologie
                            LF UK a FN Hradec Králové
Posudek oponenta na dizertační práci

Ing. Jan Kotouček

Příprava a charakterizace komplexních nanočástic s využitím zejména frakcionace v tokovém poli a pokročilých spektroskopických metod


Práce vznikla pod Ústavem fyzikální a spotřební chemie FCH VUT v Brně v rámci studijního programu Fyzikální chemie, místem realizace bylo oddělení Farmakologie a imunoterapie VUVeL, pracoviště školitele doc. J. Turánka. Práce má formát souboru prací autora (5 publikovaných a 3 v různém stadiu publikování) s úvodem do problematiky, je psána anglicky, s občasným výskytem drobných chyb. Oceňuji detailní popis autora dizertace co se týká jeho podílu na těchto publikacích.

Zaměření práce je velmi aktuální - využití nanomateriálů pro transport bioaktivních látek a zobrazování v různých oblastech biomedicínského využití.

Teoretický úvod (cca 50 stran, 107 citací) prezentuje základy struktury liposomů, klasické metody jejich přípravy uvádí kap. 2.1. Doplní je pak popis modifikace povrchu z hlediska cílené dopravy léčiv a dalších biopreparátů v rámci organismu. Nádavkem jsou přidány informace o virům podobných částicích, nanodiamantech a bakteriálních schránkách využitelných pro obdobné účely. Dále je pozornost věnována "field flow" technikám; v jinak přínosné matematické části by prospěl náčrtek naznačující vzájemnou orientaci geometrických os a zúčastněných toků. Zajímavé jsou uváděné příklady úspěšných aplikací na separaci různých typů nanočástic. Poté je pozornost věnována technikám rozptylu světla a opět je prezentována relevantní matermatická teorie, detailněji je prezentována varianta s více úhly dopadu světla a je diskutován vliv el. pole při elektroforetické variantě DLS. Jako další parametr ovlivňující agregaci nanočástic je zaveden zeta-potenciál. Tato část je zpracována velmi kvalitně a čtenář snadno pochopí, o co vlastně v jednotlivých technikách a metodikách jde.

Hlavní část dizertace tvoří publikace. Na článku P1 je J. Kotouček (JK) prvním autorem (celkem 15), a obsah tohoto sdělení v podstatě nejlépe odpovídá vlastnímu zaměření dizertace. Časopis Scientific Reports patří mezi velmi kvalitní. Náplní je příprava liposomů v mikrofluidním systému a vliv složení fosfolipidů a obsah cholesterolu na jejich vlastnosti.

Práce P5 (Molecular Pharmaceutics, 20 autorů) a P2 (Nanomaterials, 21 autorů) jsou zaměřeny na nanodiamanty a jejich interakce s lysozomy, v porovnání s jinými nanomateriály na bázi uhlíku. Vkladem JK je DLS charakterizace těchto nanomateriálů, podobně jako v P3 (Pharmaceutics, 19 autorů) v případě lipozomů cílených na krevní sraženiny pomocí modifikace anti-fibrinovými proteiny. A obdobný úkol ho čekal i v publikaci P4 (Carbohydrate Polymers, 22 autorů) - povrchová modifikace lipozomů mananovými ligandy pomocí click-konjugace za účelem stimulace dendritických buněk.

Práce S1 a také M1 konečně pojednávají o AF4 technice pro separaci chimerních multimerních proteinových struktur na bázi virových kapsid; ukazuje se, že AF4 je šetrným postupem a nevede ke vzniku agregovaných artefaktů. Cenná je také korelace velikosti nanočástic získaných různými metodikami. M2 je zaměřena na vývoj nových imunoterapeutik.

U prací typu M (manuscript in preparation) by se neměl uvádět název časopisu; pokud to nebylo zasláno do redakce, tak to může být cokoliv (...). M1 a M2 stejně nejsou v práci přítomny ani jako přílohy, lze tedy pochybovat, zda tyto texty nyní vůbec existují (prosím přinést k obhajobě).

Při hodnocení dizertací obecně preferuji formát daný úvodem do problematiky a přiloženými publikacemi. U dvaceti-autorských prací nicméně již tento koncept zachází trochu do extrému, protože čistě matematicky vychází podíl jednotlivce kolem 5%, a otázkou se stává, zda lze do práce vložit kompletně 95% výsledků někoho jiného? (A proč má oponent číst a hodnotit 95% málo relevantních výsledků?) Nicméně oceňuji, že je zde součástí dizertace jedna hotová prvoautorská práce.

Závěrem lze konstatovat, že stanovené cíle práce byly splněny a že Ing. Jan Kotouček prokázal tvůrčí schopnosti v dané oblasti výzkumu a práce splňuje požadavky standardně kladené na disertační práce v daném oboru.


V Brně dne 31.8. 2020                        


                                Doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
                                Ústav biochemie PřF MU, Brno