dizertační práce

Vytipování a sledování exprese genů ovlivňujících syntézu kyseliny hyaluronové ve streptococcus equi subsp. zooepidemicus pomocí technologie dna čipů a real time PCR

Text práce 3.73 MB Teze 2.32 MB

Autor práce: Ing. Radka Hrudíková

Ak. rok: 2020/2021

Vedoucí: doc. RNDr. Vladimír Velebný, CSc.

Oponenti: prof. MUDr. Ondřej Šeda, Ph.D. , RNDr. Jan Bobek, Ph.D.

Abstrakt:

Kyselina hyaluronová (HA) je biologicky významnou látkou, která je využívána v potravinářském, farmaceutickém a především kosmetickém průmyslu. Jde o glykos- aminoglykan běžně se vyskytující v lidském těle. Jako jeden z virulentních faktorů ji některé bakteriální kmeny produkují ve formě kapsule. Obaluje bakteriální buňku za účelem ochrany před imunitním systémem napadeného organismu. Jedním z hlavních producentů je Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Tato Gram-pozitivní bakterie je využívána ve společnosti Contipro a.s. k výrobě HA. Produkční kmen CO4A byl získán náhodnou fyzikální mutagenezí. Cílem této práce bylo prostudovat změny v genomu a transkriptomu kmene, které vedly k významnému navýšení produkce HA. Genom kmene CO4A byl osekvenován a porovnán s referenčním kmenem ATCC35246 [1]. Velikost genomu je 2 167 251 bp a bylo v něm identifikováno 83 relevantních variant (59 SNV a 34 indelů). Varianty v kódujících oblastech byly anotovány a byly také určeny změny aminokyselinové sekvence. U SNV mutací došlo ke změně aminokyselinové sekvence v 45 případech, u indel mutací byla změna aminokyselinové sekvence identifikována vždy. U obou kmenů byla sledována míra exprese vybraných skupin genů metodou DNA čipů. U kmene CO4A byla pozorována kaskáda zvýšené míry exprese genů metabolismu aminocukrů, vedoucí k syntéze UDP-N-acetylglukosaminu (navýšení exprese u těchto genů v porovnání s ATCC35246 bylo v průměru o 28 %). Následně byla míra exprese vybraných genů ověřována real-time PCR (qPCR). Zde nebyl identifikován signifikantní rozdíl míry exprese u genů has operonu u obou kmenů. Metodou qPCR byl sledován také vliv suplementace kultivačního média N-acetylgukosaminem (GlcNAc), který je jedním z prekurzorů syntézy HA. Byl zaznamenán pozitivní vliv suplementace kultivačního média externím GlcNAc na expresi vybraných skupin genů a také na výtěžek HA z média po ukončení kultivace u kmene CO4A (nárůst výtěžku v průměru o 17 %). U kmene ATCC35246 byl sledován pozitivní vliv na výtěžek HA z kultivací (nárůst výtěžku v průměru o 9 %), ale nebyla zjištěna signifikantní změna míry exprese u vybraných skupin genů.

Klíčová slova:

kyselina hyaluronová, Streptococcus zooepidemicus, genová exprese, celogenomová sekvenace, DNA čipy, real-time PCR, referenční gen, bioinformatika, regulace exprese genů

Termín obhajoby

16.9.2020

Výsledek obhajoby

obhájeno (práce byla úspěšně obhájena)

znakmkaPznamka

Průběh obhajoby

Předseda komise představil doktorandku. Ing. Hrudíková absolvovala zahraniční stáž v rámci programu Erasmus+ na NTNU v Norsku. Od roku 2012 ma již řadu pracovních zkušeností. V první polovině roku 2013 absolvovala pedagogickou praxi (vedení praktik z biochemie). Účastnila se konferencí v ČR a v zahraničí. Má 2 články v impaktovaných časopisech. Rovněž má podíl na 1 patentu.

Jazyk práce

čeština

Fakulta

Ústav

Studijní program

Fyzikální chemie (DKCP_FCH_4)

Studijní obor

Fyzikální chemie (DKCPO_FCH_4)

Složení komise

prof. Ing. Michal Veselý, CSc. (předseda)
prof.MUDr. Ondřej Šeda, Ph.D., oponent (člen)
RNDr. Jan Bobek, Ph.D., oponent (člen)
prof. Ing. Michal Čeppan, CSc. (člen)
prof. Ing. Martina Klučáková, Ph.D. (člen)
doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D. (člen)

Soubor vložený vedoucím Velikost
Posudek vedoucího práce [.pdf] 100.15 kB

Posudek oponenta
prof. MUDr. Ondřej Šeda, Ph.D.

Soubor vložený oponentem Velikost
Posudek oponenta [.pdf] 331.48 kB

Posudek oponenta
RNDr. Jan Bobek, Ph.D.

Oponentský posudek dizertační práce Ing. Radky Hrudíkové „Vytipování a sledování exprese genů ovlivňujících syntézu kyseliny hyaluronové ve Streptococcus Equi Subsp. Zooepidemicus pomocí technologie dna čipů a real time PCR“

Vypracoval RNDr. Jan Bobek, Ph.D.

Práce Ing. Hrudíkové se věnuje diferenciální genomové a expresní analýze dvou kmenů Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, které se komerčně využívají pro produkci kyseliny hyaluronové. V práci byly použity moderní přístupy sekvenace genomu i celogenomové exprese genů metodami NGS, qPCR a microarrays. Následné analýzy získaných dat byly zaměřeny především na osvětlení zvýšené produkce hyaluronové kyseliny u zkoumaného kmene CO4A.
Téma je aktuální i vzhledem k tomu, že získané poznatky mohou být okamžitě komerčně využitelné. Práce splňuje nadefinované cíle.
K práci mám následující připomínky a několik dotazů:
•    V názvu práce na str. 2 je streptococcus psán malým písmenem. V oficiálním názvu jsou naopak všechna počáteční písmena názvu organismu velká. Správně začíná rodový latinský název velkým písmenem a druhový malým a píše se kurzívou.
•    V práci bylo objeveno několik mutací či rozdílné exprese genů, které by mohly mít vliv na produkci HA. Ovšem překvapivě vůbec se nevěnuje rozdílům v expresi oblastí genomu nekódujících proteiny. Přitom právě bakteriální malé sRNA jsou důležitými regulátory genové exprese a mohou různé metabolické dráhy přímo ovlivňovat.
•    Anotace i úvod celé práce je napsán dobře a dobře uvede čtenáře do studované problematiky i výsledků. Nicméně autorka u těchto dvou kapitol opakuje některé pasáže.
•    Jaké máte dle výsledků pro firmu doporučení pro další navýšení produkce HA?
•    V teoretické části jsou použité obrázky z jiných prací. Reference jsou uvedeny. Nicméně hned u obr. 1. je obrázek překopírován z jiného zdroje, než je uvedeno.
•    V textu je uváděn gen gpi, ale pravděpodobně jde o pgi, tedy gen pro fosfoglukoizomerázu?
•    „Jako negativní kontrola pro analýzy qPCR byla zvolena cDNA připravená z celkové RNA bakterie Escherichia coli DH5α.“ Je vždy velice dobré používat negativní kontroly k prováděným experimentům. Nicméně mám připomínku ke správnosti užití takové negativní kontroly, kdy ani není možné předpokládat pozitivní výsledek. V případě qPCR jde asi nejvíc o to vyloučit možnost kontaminace chromozomální DNA, která zkresluje získaná expresní data. Můžete takovou kontaminaci u svých vzorků vyloučit? Jakou negativní kontrolu byste za tímto účelem použila?
•    Analýza Ct hodnot vybraných skupin genů metodou 2(-ΔΔCt). Byl studován i vliv suplementace média GlcNAc na expresi genů. Data byla normalizována k expresi genu gyrA. Můžete vyloučit možnost, že přítomnost GlcNAc ovlivní expresi tohoto referenčního genu, což by ve finále zkreslilo získaná data?
•    Výsledky a diskuse celé práce jsou shrnuty v jediné kapitole. V tomto případě, kdy se jedná o zhodnocení velkého počtu dat, je dle mého názoru takové členění oprávněné.
•    Z hlediska úrovně české gramatiky je práce psaná dobře, nicméně lze najít chyby, a to především v interpunkci. Jako příklad uvádím následující větu: „Změny v nukleotidové sekvenci mohou mít vliv na tvorbu sekundárních struktur mRNA a tím signifikantně snížit efektivitu exprese aniž by došlo ke změně v sekvenci aminokyselinového řetězce [131].“ Jinde se jedná o věty neukončené, např. tím, že chybí sloveso: „Mutace identifikovaná v genu Sesec_00473 (Ile→Val), který kóduje chaperon DnaK.“
•    U problematiky DnaK chaperonu (str. 37) bych se ještě pozastavil. Uvádíte, že může mít vliv na patogenicitu a stresovou rezistenci u streptokoků. Můžete prosím tento mechanismus, dle uvedené reference, konkretizovat?
•    Pozorovala jste nějaké morfologické rozdíly mezi oběma studovanými kmeny? Např. na str. 55 a 65 i jinde uvádíte rozdílné exprese genů, které by mohly mít vliv na syntézu peptidoglykanu. Nepozorovala jste tedy např. rozdílnou tloušťku buněčné stěny?
•    Na str. 97 (a jinde) nejsou uvedeny celé názvy enzymů eno, pyk, ldh; názvy genů by měly být kurzívou, názvy proteinů velkým písmenem.
•    Str. 93 i dále: „Lipoteichoová kyselina je stejně jako kyselina hyaluronová jedním z virulentních faktorů a povrchový protein [133, 146].“ Nejsou to proteiny, větě nerozumím.
•    Grafy 8-28: popis a vysvětlení grafů je nedostatečné. Jaká byla změna v expresi genů bez a po  suplementaci GlcNAc?

V práci studentka analyzovala množství sekvenčních a expresních rozdílů z naměřených dat a nad získanými výsledky vede cílenou a přesvědčivou diskusi. Nicméně práci (i z mého pohledu proto, aby mohla být dobře opublikovaná, viz. níže) chybí jakýsi finální experiment, který by nás mohl přesvědčit o efektivitě celého výzkumu, např. na základě dosavadních výsledků navrhnout mutaci referenčního kmene, která by přímo mohla ovlivnit produkci HA.
Studentka ve svém CV uvádí své spoluautorství 4 článků publikovaných v impaktovaných časopisech a jednoho patentu. Ani v jednom případě však není první autorem. Ani jedna z uvedených publikací se přímo netýká problematiky dizertační práce. Navíc dvě z těchto čtyř uváděných prací nejsou vědecké články, ale jedná se jen o konferenční abstrakty (Abstracts of the 17th European Congress on Biotechnology).
Ponechávám na rozhodnutí komise, zda je tato skutečnost překážkou k úspěšné obhajobě. Pokud ne, tak z mojí strany nejsou jiné námitky a mám za to, že studentka prokázala tvůrčí schopnosti v dané oblasti výzkumu a práce splňuje požadavky standardně kladené na disertační práce v daném oboru.

V Curychu dne 24. 8. 2020